循环细胞在乳腺癌诊疗中的应用

循环 细胞在乳腺癌诊疗中的应用 [标签:url] [标签:科室] 摘要：近年来很多探讨CTC检测的研究是应用强生公司的循环 细胞检测(CellSearch)系统开展的，该系统利用上皮细胞表达细胞黏附蛋白(EpCAM)、细胞角蛋白(CK)的特点，采用与免疫磁珠结合的方法捕获血液中的CTC。 随着遗传学、分子病理学的发展，乳腺癌的诊疗已经步入分子分型指导下的个体化诊疗时代[1]。循环 细胞(circulatingtumorcell，CTC)是临床检测理想的标本来源，可对 治疗进行实时全面监测，在 早期诊断、 及时评价、病情监测、耐药析因、预后判断、 个体化治疗用药指导等方面均有大量应用[2]。 1CTC计数 目前在乳腺癌领域已有大量探索，较为成熟的研究多集中于通过CTC计数的动态监测实现乳腺癌的 评价、复发监测、预后判断等方面[3，4，5]。 1.1在晚期乳腺癌 监测与预后评估方面的应用 研究证实血液中检测到的CTC可以作为乳腺癌、 癌、结肠癌等 的独立预后因素[6]，美国食品和药物监督管理局批准CTC检测与分析系统用于转移性乳腺癌、结直肠癌及 癌的预后评估[7]。近年来，CTC检测应用于晚期乳腺癌的 监测与预后判断方面的研究取得了一系列进展[8]。 1.1.1 监测： 近年来很多探讨CTC检测的研究是应用强生公司的循环 细胞检测(CellSearch)系统开展的，该系统利用上皮细胞表达细胞黏附蛋白(EpCAM)、细胞角蛋白(CK)的特点，采用与免疫磁珠结合的方法捕获血液中的CTC。该系统集免疫磁珠富集技术及免疫荧光技术于一体，具有较高的特异性、敏感性和可重复性。 Cristofanilli等[6]的一项多中心的前瞻性研究应用CellSearch系统检测177例乳腺癌患者发现，CTC数目≥5个/7.5ml的患者无进展生存期(PFS)、总生存期(OS)比<5个/7.5ml者明显缩短，多因素COX比例风险回归显示，基线和初始治疗结束后第1次随访CTC计数可以作为预测PFS和OS的独立因素，认为CTC≥5个/7.5ml可被作为判断预后的指标。Bidard等[9]对欧洲17个中心开展的1944例患者的20个研究进行了整合分析，其中基线CTC计数≥5个的911例患者PFS和OS明显短于CTC计数<5个的患者。治疗开始后3～5周内CTC计数较基线增加者PFS和OS均比6～8周后才出现CTC计数增加者缩短。在预后模型中增加3～5周和6～8周CTC计数指标可明显改善其预测能力，而增加癌胚抗原(CEA)和糖类抗原153(CA153)等 血清标志物未能提高其预测能力。这项研究为CellSearch系统检测CTC计数用于转移性乳腺癌患者的 监测提供了一级证据。 许多关于CTC与 监测的研究证明了其临床应用价值[10，11]，但也有部分研究结果似乎差强人意。在SWOGS0500研究中，Smerage等[12]将在基线和第1次随访时CTC计数持续≥5个/7.5ml的123例转移性乳腺癌患者随机分为两组，一组继续维持一线化疗直至 进展，另一组更换为二线治疗方案，两组的中位PFS和OS差异无统计学意义，可能与一线治疗与二线治疗的 不同有关。 1.1.2预后判断： 通过观察治疗前外周血中基线CTC计数以及治疗过程中CTC数目的变化，可以协助进行患者的预后评估。Hayes等[13]随访177例转移性乳腺癌患者，任何时间点检测出CTC计数>5个/7.5ml对预后判断的意义一致，均较CTC计数<5个/7.5ml者更易进展。CTC<5个者中位PFS明显比CTC>5个者延长；CTC计数<5个者OS也明显比CTC计数>5个者长。CTC计数从≥5下降到<5者其PFS与OS均较CTC计数持续较高水平者长。 1.1.3监测 进展： CTC计数也可以作为早期监测 进展的指标，CTC检测比影像学评价的观察者间变异性小，特异性相对更高[8]。Liu等[10]开展了一项前瞻性临床研究以探讨CTC计数与影像学检查在 监测上的价值，结果显示CTC计数与影像学所示的疾病进展程度相关，CTC计数比影像学检查提早7～9个周监测到疾病进展，化疗后CTC计数≥5个则高度提示疾病进展，研究认为将连续CTC计数监测与影像学检查相结合，可以提高 评价的准确性，协助制定 最佳的个体化诊疗方案。在治疗过程中不同时间节点采血进行分析可以协助临床医师更加精确的预测临床获益，减少患者接受无效治疗的时间，指导制定获益最大的治疗方案。 1.2对早期乳腺癌的预后价值 在早期乳腺癌中CTC计数的临床研究远少于晚期乳腺癌，但也有研究证明其与预后不佳相关。SUCCESS研究对2000余例乳腺癌患者辅助化疗前进行CTC检测，随访显示化疗开始前CTC阳性是无病生存期(disease-freesurvival，DFS)和OS的独立危险因素[14]。基线时CTC≥5个常提示预后不佳。对于早期乳腺癌患者，由于在现有技术水平下CTC检出率相对较低，其临床应用受到了一定的限制[5]。 2CTC受体类型检测 乳腺癌治疗方案的制定依赖于分子分型的指导，近50%的激素受体阳性转移性乳腺癌患者对内分泌治疗不敏感，15%～30%的患者在接受内分泌治疗的第2～3个月内 进展[15]。由于 在侵袭和转移形成转移灶的过程中可能获得了新的生物学特征，其分子分型可能发生了一定程度的改变。有学者应用CTC受体状态检测实现对雌激素受体(ER)和(或)孕激素受体(PR)状态的实时监测，以指导治疗方案的选择[15，16]。Aktas等[16]对193例转移性乳腺癌患者进行了CTC检测，对其中87例CTC阳性患者的 原发灶与CTC的ER和(或)PR状态进行对比发现，ER、PR状态在两者间不吻合率分别占41%和45%。即便是在原发灶ER和(或)PR阳性患者，对CTC的ER和(或)PR检测结果也多显示为阴性。Banys等[17]对比209例分期为pT1-4、pN0-2、M0的初治乳腺癌患者术前和术后CTC的人表皮生长因子受体2(HER2)、ER、PR状态发现，切除 病灶后CTC的分型未发生明显改变，同时术前术后CTC类型似乎也不能反映原发灶的分子病理分型。研究发现ER、Bcl-2低表达而HER2、Ki-67高表达患者内分泌治疗相对不敏感，Paoletti等[15]将CTC计数与ER、Bcl-2、HER2和Ki-67相结合计算出CTC-ETI指数，以推测患者对内分泌治疗的 ，已有前瞻性研究正在对其应用价值进行验证。 3CTC的分型 侵袭和转移过程中发生上皮间质转化(epithelialmesenchymaltransition，EMT)时，上皮细胞极性丧失，与周围细胞和基质的接触减少，细胞间黏附作用降低，细胞的迁移和运动能力增强[18，19]，也增加了对包括紫杉醇和蒽环类药物在内的常规抗 治疗的耐药性[20]。EMT后 细胞在血液中存活率更高。EMT转化在三阴性或HER2阳性的乳腺癌患者中更多见，在ER阳性乳腺癌患者中相对少见，与不同类型乳腺癌的转移率相对应[21]。 Yu等[22]应用RNA原位杂交技术在乳腺癌研究中发现，患者体内除了上皮表型的CTC以外，还存在一些间质表型的CTC，甚至部分CTC同时呈现不同程度的上皮和间质的混合表型，通过对不同分子分型的乳腺癌CTC细胞亚型的比较发现，ER和(或)PR阳性患者CTC以上皮型为主，三阴性乳腺癌CTC类型以间质型为主，HER2阳性乳腺癌以间质型为主，也包含混合型CTC。此研究还动态监测了11例乳腺癌患者疾病进程中的CTC数量及分型，发现患者治疗有效时检测到间质表型CTC比例明显下降，疾病进展时检测到的CTC则多数为间质表型，提示间质表型CTC与治疗抵抗相关。Bardia和Haber[23]认为新型CTC分离技术不仅能识别上皮性标志物，还可以捕获经历了EMT的CTC，不同分型的CTC检测在 评价以及指导治疗方案选择等方面的应用有待进一步研究验证。Wu等[24]采用新型的多重mRNA原位分析方法，同时标记多种针对CTC的RNA探针，分别对表达上皮型基因的CTC和表达间质型的CTC进行不同荧光染料标记，进而对其进行鉴定和分型，目前已有前瞻研究对其在 评价、 负荷评估、指导预后等方面的临床应用价值进行验证。 4CTC领域新技术的探索 4.1单细胞测序技术在探索CTC异质性方面的应用 随着高通量测序技术的发展，全基因组的扩大，转录组文库的构建，使得CTC测序分析已经可以精确到单细胞水平。单细胞测序(singlecellsequencing，SNS)技术[25]的优势之一在于对生物学异质性的评估，包括CTC亚群的遗传变异性分析。Yu等[22]开展了第1个针对单个CTC的转录组分析，发现包括转化生长因子-β和FOXC1在内的EMT相关基因的异常表达与EMT过程相关。Pestrin等[26]应用SNS分析转移性乳腺癌患者单个CTC的磷脂酰肌醇-3催化亚单位α突变状态异质性，证明了应用非侵入性方法分析转移性乳腺癌患者CTC分子学特征的可行性。Polzer等[27]将用于CTC分离富集的CellSearch技术、实现单细胞隔离分析的DEPArray技术进行全基因组扩增Ampli1 Akit技术有机结合，通过CTC的SNS分析获得HER2扩增、PIK3CA突变、基因拷贝数改变等信息，用于探索个体化诊疗方案的确定以及耐药机制的研究。 4.2CTC培养在药物敏感性检测方面的应用 在体外或动物模型中进行CTC培养有助于了解CTC的功能特性和转移潜能，通过CTC培养可以获得相对纯净的 细胞株，为进一步开展多位点突变分析创造条件，协助进行药物敏感性评估[28]。Yu等[29]对激素受体阳性转移性乳腺癌患者的CTC进行分离和培养，其中6例成功传代的CTC均来自未治疗或治疗进展的患者，而9例对治疗有反应患者的CTC均未能成功传代。通过对CTC细胞株基因测序发现了PIK3CA、ESR1和成纤维细胞生长因子受体2基因突变。对细胞株进行基于多基因位点突变的药物敏感性检测可能为乳腺癌的治疗提供新的靶点，指导针对个体治疗方案的选择[30]。 5结语 CTC检测可以开展基于全细胞水平的DNA、RNA、蛋白质分子分析以及指导个体化治疗选择的功能研究，协助寻找新的治疗靶点[7]。近年应用各种CTC检测技术进行 监测、预后判断、药物敏感性检测的研究层出不穷，但目前各种检测手段尚未形成国际标准，很难将这些研究结果进行横向比较[5，31]，仍需通过多中心、大样本、前瞻性临床研究进一步证实CTC检测在乳腺癌诊疗方面的临床应用价值，获取可靠的临床依据，实现乳腺癌的个体化诊疗。